一、材料和試劑
1、0.01M PBS（pH7.4）： NaCl 8.0g； KCl 0.2g； Na2HPO4 1.44g； KH2PO4 0.24g； ddH2O至1000ml ； 高壓滅菌,分裝。
2、0.25%胰酶：稱取EDTA 0.02g NaCl 0.8g KCl 0.04g 加三蒸水100ml溶解后加0.25g 胰酶,輕輕攪動,使胰酶溶解,不要產(chǎn)生泡沫,加酚紅少許,調(diào)PH值到8.2-8.6,過濾除菌,分裝10ml/管,-20℃保存,臨用前預(yù)溫到37℃。
3、誘導(dǎo)液（TPA）：12-鄰-十四酰-佛波醇-13-乙酸酯（12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate,TPA）溶于丙酮，配成20mg/ml。
二、實驗步驟
（一） 、用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板制備貼壁細(xì)胞抗原（正常貼壁細(xì)胞）
1、HFF,NIH3T3細(xì)胞用含10%血清DMEM*培養(yǎng)液在75cm2培養(yǎng)瓶中單層培養(yǎng),使密度達(dá)到90%
2、傾去培養(yǎng)液,用無菌PBS液5-10ml洗細(xì)胞一次,用無菌吸管吸干PBS液。
3、加0.25%胰酶（從-20℃取出,在37℃預(yù)溫）75平方厘米培養(yǎng)瓶加1ml,37℃溫箱或有經(jīng)驗者可在酒精燈周圍,控制溫度約37℃左右,輕輕搖勻使胰酶充分覆蓋細(xì)胞表面。
4、觀察到細(xì)胞有松動,成流沙狀下落;或在顯微鏡下觀察,細(xì)胞已有收縮變圓時,用無菌PBS液15-20ml,終止反應(yīng)。
5、輕輕吹打下細(xì)胞,使細(xì)胞單個分散,并充分混勻1500轉(zhuǎn)/分離心5-10分鐘,去掉上清液
6、打散細(xì)胞,加10ml含血清DMEM*培養(yǎng)液混勻,取10ul在顯微鏡下計數(shù),計算細(xì)胞濃度。
7、用含10%血清培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至1×104個/100ul,每孔（96孔）接種200ul（即2×104個細(xì)胞/孔）,37℃ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
8、次日顯微鏡下觀察,細(xì)胞是否*貼壁（一般24小時可*貼壁）倒去培養(yǎng) 0.01M PBS液先二次（孔中加滿PBS,輕輕倒掉）并在濾紙上扣干,反復(fù)3次）應(yīng) 注意加液的力度,不能太大,以免沖掉細(xì)胞,倒去上清液在濾紙上扣干水份,但保持細(xì)胞濕潤。
9、加90%冷丙酮固定,每孔200ul,5-10min 摔去冷丙酮,用PBS洗三次,扣干。
10、在培養(yǎng)板上作好標(biāo)記（細(xì)胞名稱,制備時間）。
11、保鮮膜封好,-70℃保存。
（二） 、懸浮細(xì)胞玻片法的抗原制備
1、 25平方厘米玻璃瓶用含10%血清的1640*培養(yǎng)液培養(yǎng)BCBL-1細(xì)胞,密度達(dá)到80-90%
2、加樣槍充分吹勻細(xì)胞,收集于離心管中。
3、1500轉(zhuǎn)/分離心5-10分鐘,棄去上清液。
4、打勻細(xì)胞,用PBS洗二次,棄去上清。
5、打勻細(xì)胞,加少量PBS液（根據(jù)肉眼觀察細(xì)胞溶液的濁度估計）混勻,取少量在顯微鏡下計數(shù),調(diào)整濃度,估算在玻片上每個細(xì)胞涂片圈位 （12圈）接種細(xì)胞1×104個。
6、室溫下干燥,然后加100%的冷丙酮室溫固定3-5分鐘,PBST洗二遍。
7、室溫干燥,作好標(biāo)記然后放入玻片盒 ,玻片盒用塑料袋密封,并放一袋防潮劑,-20℃保存,一個月內(nèi)有效。
（三） 病毒感染細(xì)胞抗原的制備
1、96孔培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞的病毒感染及病毒抗原的制備
1） 未感染細(xì)胞接種到96孔板（方法見”懸浮細(xì)胞玻片法抗原制備”1-5步）,并*貼壁。
2） 摔去PBS液,加入少量病毒液（加入量由先做棋盤試驗來確定濃度,或先測定病毒滴度而定,且病毒液用2%-5%血清DMEM*培養(yǎng)液稀釋）,每孔50ul,搖勻,使充分覆蓋細(xì)胞表面 ,37℃ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)（MCMV感染NIH3T3 HCMV感染HFF）。
3） 每天觀察細(xì)胞形態(tài)變化,早期CPE為細(xì)胞腫脹,中期聚集,晚期則圓縮。
4） 當(dāng)圓縮細(xì)胞達(dá)到10%-30%左右,細(xì)胞層出現(xiàn)明顯的病灶,同時還有正常細(xì)胞未感染,即可收獲（一般情況下3-4天）。
5） 倒去上清（倒入有消毒液容器以防止污染環(huán)境）,用無菌PBS液洗2次（加滿培養(yǎng)孔,倒掉,在濾紙上扣干）。
6） 倒去上清,加90%冷丙酮室溫固定5-10min,每孔200ul 。
7） 摔去冷丙酮,用PBS洗三次,扣干。
8） 在培養(yǎng)板上作好標(biāo)記（病毒抗原名稱,制備時間等）。
9） 保鮮膜封好,-70℃保存。
2、BCBL-1細(xì)胞的誘導(dǎo)和KSHV病毒抗原的制備
<1> BCBL-1細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)到50%
<2> TPA（12-0-酰佛波醇-13-乙酸酯），每毫升培養(yǎng)液加40ug（TPA預(yù)先配成 20mg/ml）。
<3> 誘導(dǎo)三天后，收集少量細(xì)胞進(jìn)行ICC預(yù)實驗。
<4> KSHV陽性細(xì)胞達(dá)到10%-30%時，可做細(xì)胞涂片，陽性細(xì)胞>30%時,可用于制備病毒細(xì)胞裂解液。
<5> KSHV陽性細(xì)胞達(dá)到10%-30%時,即可收獲細(xì)胞加樣槍充分吹勻細(xì)胞,收集于離心管中。
<6> 2000轉(zhuǎn)/分離心5-10分鐘,棄去上清液。
<7> 打勻細(xì)胞,用PBS洗二次,棄去上清。
<8> 打勻細(xì)胞,加少量PBS液（根據(jù)肉眼觀察細(xì)胞溶液的濁度估計）混勻,取少量在顯微鏡下計數(shù),調(diào)整濃度, 估算在玻片上每個細(xì)胞涂片圈位 （12圈）接種細(xì)胞1×104個。
項目 MCMV HCMV KSHV
血清稀釋度 1:50 1:100 1:200 1:100 1:500 1:1000 1:50 1：100 1:200
測血清用二抗
HRP-Anti Mouse IgG（fc） Sigma
或HRP-Anti Mouse IgG+A+M Sigma Bio-Anti mouse IgG F（ab’）2 Sigma HRP-Anti Mouse IgG（fc） Sigma
或HRP-Anti Mouse IgG+A+M Sigma
測上清用二抗 Bio-Anti mouse IgG F（ab’）2 Sigma Bio-Anti mouse IgG F（ab’）2 Sigma HRP-Anti Mouse IgG（fc） Sigma
或HRP-Anti Mouse IgG+A+M Sigma
<9> 室溫下干燥,然后加100%冷丙酮室溫固定3-5分鐘,PBST洗二遍。
<10>室溫干燥,作好標(biāo)記后放入玻片盒,玻片盒用塑料袋密封,并放一袋防潮劑,-20℃保存,一個月內(nèi)有效。
三、說明
1、 測病毒細(xì)胞ICC血清稀釋度及使用的二抗
2、細(xì)胞病變作用分三種類型
1） 全變型：即整個細(xì)胞都發(fā)生改變。
<1>整個細(xì)胞都發(fā)生腫脹,胞漿呈顆粒樣變,胞膜邊緣不整齊。
<2>整個細(xì)胞都發(fā)生皺縮,變圓直至碎裂,脫落等,多見于病毒。
2） 包涵體型：即反映在細(xì)胞核或細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)病毒引起的包涵體。。
3） 融合型：即指多數(shù)病變細(xì)胞發(fā)生相互事例融合而呈”巨細(xì)胞”,但單個細(xì)胞的胞核仍可分辨。
3、細(xì)胞病變程度表示方法
通觀整個”單層區(qū)”權(quán)衡總的情況,雙下列符號表示其病變程度:
? 無細(xì)胞病變
? + 25%以下的細(xì)胞有病變
? ++ 25%-50%的細(xì)胞有病變
? +++ 50%-75%的細(xì)胞有病變
? ++++ 75%-100%的細(xì)胞有病變
四、注意事項
1、病毒液應(yīng)保存在-70℃,4℃保存病毒液病毒滴度會降低,保存不長久。
2、每次從冰箱取出抗原板或抗原片時,應(yīng)在37℃預(yù)溫去掉水霧,用前要用3%的雙氧水（現(xiàn)配現(xiàn)用）除掉病毒細(xì)胞中的內(nèi)源性過氧化物酶。
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